患兒的診斷主要根據血pa測定，患兒血中pa多在20mg/dl以上。經低pa控制后下降。 典型患兒還可顯示尿三氯化鐵實驗，2，4二硝基苯肼試驗陽性，但尿液檢查不穩定，漏診率高，只能作參考，不適于作新生兒的篩查。
經典型pku需與高苯丙氨酸血癥和bh4缺乏癥相鑒別：
1. 高苯丙氨酸血癥：患兒血pa濃度在4~20mg/dl，酪氨酸正常或稍低，預后多良好，不需特殊治療。 如果在正常飲食狀態下(蛋白質攝取量為2~3g/kg/日)， 患兒血pa濃度>10mg/dl，或連續數日血pa>7mg/dl，也可以進行低苯丙氨酸飲食治療。
2. bh4缺乏癥(異型pku)：bh4缺乏癥約占遺傳性高苯丙氨酸血癥的1~3%，南方多于北方。 患兒多于嬰兒期出現驚厥、發育落后、吞咽困難、肌張力低下或亢進，即使早期進行低苯丙氨酸飲食治療，血pa濃度降至正常，神經系統損害仍會進行性加重。 目前已發現四氫喋呤合成酶、二氫喋呤還原酶、三磷酸鳥苷還化水解酶等三種酶的缺陷與bh4生成障礙有關。確診時應進行尿喋呤譜分析、bh4負荷試驗及酶活性分析。bh4是苯丙氨酸羥化酶、酪氨酸羥化酶和色氨酸羥化酶的輔酶，不僅參與多巴、腎上腺素、5-羥色氨酸的合成， 因此，在治療中除補充bh4外，尚需補充左旋多巴，5-羥色氨酸，并根據體重、血pa濃度及尿喋呤分析等調節劑量。本病非新生兒疾病篩查范圍。